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五步教你跑出漂亮的大分子western-blot图诀窍

       如果你的蛋白分子量大于150KD,但苦于一直跑不出好看的western-blot,那么这篇文章,你一定得看。

       选对凝胶很重要
       3种常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH还有上升的趋势,可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。
       Bis-Tris凝胶的PH为6.4,相对Tris-Glycine凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如DTT,以维持蛋白的还原性。
       Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。 跑大分子蛋白时,我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

       凝胶浓度很重要
       既然选择了Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。

       提高转移buffer中的SDS,减少甲醇
       转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比(10%或更低)来避免这种情况发生。 为了进一步确保蛋白质不会沉淀,考虑添加SDS至终浓度为0.1%。SDS向蛋白添加均匀的负电荷,使得它们更容易从凝胶转移到膜上。

       选择合适的膜
       膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜。如前面所说,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇,目的蛋白转印的机会更高。两种类型的膜都有各种孔径尺寸,常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样,较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质(> 20kDa)可以用0.45um膜转移,避免使用0.2um孔径。

       增加转印时间
       在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后,转印正式开始。半干转快且方便,但不适用于大分子蛋白。我建议湿转,因为大分子蛋白转移时间很慢,推荐350-400 mA转移90min或 4°C,40 mA,转印过夜。
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